【目的及应用】： 用于组织、细胞蛋白提取和鉴定

【试剂及设备】： RIPA 蛋白裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒、10×电泳缓冲液、10×电转缓冲液、10×TBST 、 抗体封闭液、ECL 显色试剂盒、12％预置胶 kit、 低温高速离心机，涡旋器、酶标仪，电泳仪，电泳槽，转膜槽，KODAK 图像分析系统，摇床

【实验步骤】：

a 蛋白提取：RIPA 蛋白裂解液

1、消化细胞入 50ml 离心管，1000rpm 离心 10min，弃上清，每管中加 1ml 1XPBS，重悬细胞并转移至 1.5ml 离心管中，2000rpm 离心 10min，弃上清

2、加入 5 倍体积的 RIPA 蛋白裂解液约 400ul,（RIPA 使用前加入 PMSF，使 PMSF 的最终 浓度为 1mM）冰浴中放置 15 分钟，且每隔 5 分钟在涡旋器震荡 30 秒，如此反复，使 RIPA 充分裂解细胞

3、离心 12000g，4℃，10 分钟，将上清转移到新的离心管中， 即得细胞总蛋白产物，放入－80℃冰箱中保存 

b 蛋白定量： BCA Protein Assay Kit, 23227，PIERCE, -20℃保存 标准曲线制备（参照说明书）

1. 微孔板测定蛋白含量：（7 个标准+6 个样本）×0.2WR（工作液）=2.6ml

2. WR（工作液）准备：2.5ml A 液+0.5ml B 液=3.0ml

3. 测定步骤：10ul 样本（标准品、样本）+0.2ml WR → 振摇 30 秒 → cover plate and incubate at 37℃ for 30 min → 冷却到室温→ 562nm 酶标仪测定

c SDS－PAGE 电泳

1. 将玻璃板洗净，晾干

2. 取出配好的分离胶及浓缩胶，使用前加入 10%APS 及 TEMED

3. 配置分离胶，待分离胶凝固后配置浓缩胶并插入梳子

4. 待胶凝后拔除梳子用 ddH2O 冲洗胶孔两遍以去除残胶

5. 上样，所有蛋白样品调至等浓度后上样，Marker 也用 loading buffer 调整至与样品等体积，100 ℃煮沸 5min

6. 积层胶时电压为 80V 进行电泳，进入分离胶后电压转为 120V

7. 在目的蛋白泳动至距胶下缘 1cm 以上结束 

d 转膜

1. 电泳结束前 20 分钟左右戴上手套开始准备

2. 取胶：将胶卸下，左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上 膜与滤纸，注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分

3. 转膜：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入适量电转液，将胶平铺于海绵上， 滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧，400 mA，运行 1 小时 10 分钟

4. 转膜后可用丽春红（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）显色检查转膜效果 

e 抗原抗体反应

1.封闭：将膜从电转槽中取出，TBST 漂洗，封闭液中摇荡一小时

2.结合一抗：室温下轻摇孵育一小时或 4℃静置过夜

3.洗涤：一抗孵育结束后，用 TBST 漂洗三次，每次 5-10min。

4.结合二抗：根据一抗来源选择合适的二抗，按相应比例稀释（1:1000- 1:10000），室温轻摇一小时

5.洗涤：二抗孵育结束后，用 TBST 漂洗三次，每次 5-10min。 

f 化学发光（ECL） 在工作台上铺一张保鲜膜，将 PVDF 膜放在保鲜膜上，将 ECL 的 A 和 B 两种试剂在 EP 管内等体 积混合，然后均匀滴在 PVDF 膜的蛋白面，反应 1- 2min 后，将 PVDF 膜上多余的 ECL 工作液吸干，上机曝光 g 凝胶图象分析

检测分析结果

【注意事项】

1、蛋白提取时所有步骤都需在冰上或 4℃进行，在吸取上清液时不要吸入底部的沉淀物

2、过硫酸铵（APS）一定要新鲜，超过 2 周需重配

3、电泳、转膜时特别要注意正负极，电压电流都不能过高；转膜时“三明治”的叠放次序不 错，同时要防止产生气泡；尽量让电转温度保持在 10 度以下，冰浴为宜

4、一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，加一抗二抗要严格保证反应 时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景.