目的及应用：

应用于细胞复苏。

试剂及设备：

DMEM 细胞培养液，冻存细胞，细胞冻存管，水浴锅，安全柜，培养瓶，移液枪， 移液管（5ml，10ml），细胞培养箱。

实验原理：细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至 37℃， 使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

实验步骤：

一. 实验前准备

１.将水浴锅预热至 37℃。

２.用 75％酒精擦拭紫外线照射 30min 的超净工作台台面。

３.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶。

二．取出冻存管

１.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

２.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞。

三．迅速解冻

１.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。同时配培养液：向 50mL 离心管内加入 9mlDMEM 细胞培养液 +1mL 血清+100uL 抗生素。

２.约 1-2min 后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。向离心管中加入 4mL 培养液，充分混匀。

四. 平衡离心

配平后，放入离心机中 200×g， 离心 3min。

五.制备细胞悬液

１.吸弃上清液（先吸出气泡）。

２.将剩余的 6mL 细胞培养液加入到离心后的细胞中，使细胞重悬，充分混匀。

六.细胞计数

细胞浓度以 5×10⁵/ml 为宜。

七.培养细胞

将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，培养瓶标明细胞名称，培养液， 实验人员，实验时间；将培养瓶放入 37℃和 5％CO2 的培养箱内培养。24-48h 后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定。

注意事项：

１.一定要提前打开水浴锅，预热到 37℃。

２.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。

３.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。

４.依据冻存细胞相应的培养基种类、血清种类和其它指定的成份和比例，制备培养基。绝大多数的细胞均无法立即适应不同的基础培养基或不同的血清种类， 若因实验需要， 必须有所不同时，务必以缓慢比例渐次改变培养基组成， 确定细胞适应后，进行所需之实验。

５.FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和 HS (horse serum, 马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定的血清种类培养。

６.取出冷冻管， 立即放入 37 ℃水槽中快速解冻， 水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿， 否则易发生污染。