【目的及应用】：

双向电泳细胞/组织等样本的前期处理、纯化和定量。

【试剂及设备】：

1. 试剂 （1） PBS （2） 2D 裂解缓冲液 （3） 2D clean-up 纯化蛋白试剂盒 （4） 2D Quant 蛋白定量试剂盒

2. 设备：低温高速离心设备、振荡器、酶标仪、超声破碎仪

【实验步骤】：

1.样本处理计纯化

1.1 细胞样本处理 （1）培养细胞的收集：以胰酶消化细胞，反复吹打使其脱落，离心收集细胞(室温，1000g， 2min)；

（2） 用磷酸缓冲液(PBS)洗细胞 3 次(室温，1000×g， 2min)；

（3） 将细胞分装到 1.5ml Eppendorf 管中，吸干残留的 PBS；

（4） 加入裂解缓冲液(1.5x10 6 个细胞大约加入 100µL 裂解液)，在室 温振荡 1h，使其充分溶解；

（5） 4°C，12,000×g，离心 0.5~1h；

（6） 吸取上清以2D clean-up试剂盒进行蛋白纯化，或保存在-80°C备用。

1.2 组织样本处理

对大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质而言，同样没有一种通用的程序。但遵循的原则基本相同。下面列出一种对植物树叶总蛋白质的方法。

(1) 取材；

(2) 用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g 样品加入0.5ml 裂解液，使用组织匀浆器 匀浆30 s，进行超声裂解60 s；

(3) 将组织悬液4℃，13000×g 离心10 min；

(4) 取上清液，4℃，13000×g 离心1h；

(5) 取上清以2D clean-up试剂盒进行蛋白纯化，或保存在-80°C备用。

1.3 样本纯化

蛋白质样本在 1.5ml 微型离心管中处理，如不特殊说明，所有步骤均应在冰浴上进行。

(1) 将体积 1~100μl 的蛋白质样本(含 1~100μg 蛋白质)置于 1.5ml 微型离心管中；

(2) 加入 300μl 沉淀剂 Precipitant，在振荡器上充分混匀 20s。冰浴中(4~5℃)15 分钟；

(3) 加入 300μl 共沉淀剂 Co-Precipitant，振荡混匀 20s；

(4) 将离心管置于微型离心机中，离心管的盖轴向外。以 13000×g，4℃离心 5 分钟。离心完成后立即将离心管取出。此时管中应可见小沉淀；

(5) 应立即进行下一步以防止沉淀再溶解或播散开。轻轻以 200μl 枪头吸去上清，不要搅散沉淀；

(6) 将离心管的盖轴和离心沉淀向外，再次离心30s，使残余液体沉降至管底，用移液管将残余的上清液移去，这时管中应看不见任何液体成分；

(7) 保持沉淀不变，在其上面加入 40μl 共沉淀剂 Co-Precipitant，冰浴 5分钟；

(8) 将离心管小心地置于微型离心机中，离心管的盖轴向外，13000×g，4℃离心 5 分钟。用移液管小心移去上清液；

(9) 在沉淀中加入25μl 去离子水，振荡5~10 秒，使沉淀散开，但并未溶解于水中；

(10) 在管中加入 1ml 洗涤缓冲液 Wash Buffer (在-20℃下至少预冷1小时)和 5μl 洗涤添加剂 Wash Additive，充分振荡直至沉淀完全散开，使溶液呈现云雾状。此步洗涤至关重要，是去处杂质的重要步骤；

(11) 将管在-20℃下培育至少30分钟，每10分钟振荡 20~30 秒。在这种状态下，管子可以在- 20℃下储存最多一周，其蛋白质发生降解或修饰的可能性最少；

(12) 13000×g，4℃离心 5 分钟；

(13) 迅速地倾倒上清并将离心管倒置于滤纸上，可见白色沉淀，室温下干燥 5~10min，注意不 要过度干燥沉淀，否则再溶解就会很困难；

(14) 用 50~100μl 水化液溶解沉淀，在室温下孵育，振荡或用移液管抽吸使之完全溶解。如果沉淀过大或过干，再溶解会比较困难。用超声波处理或用样本研磨试剂盒处理可加速再溶解；

(15) 进行蛋白定量并同时 13000×g，4℃离心30分钟，去掉所有不溶物质和泡沫，直接进行水化上样；或者进行定量后保存在-80°C，在样本水化上样前13000×g，4℃离心30分钟， 尽可能去处样本中的不溶物。

2. 蛋白定量

1) 2D Quant 蛋白定量试剂盒组成 ：沉淀剂、辅助沉淀剂、铜溶液、比色剂 A、比色剂 B、 牛血清白蛋白(BSA)标准溶液 2mg/ml

2) 所需条件 ：微型离心设备、1.5ml 离心管、振荡器、酶标仪，96 孔板

3) 准备注意事项 ：开始操作前，先制备工作比色剂，即将 100 份比色剂 A 与 1 份比色剂 B 混合，每个样本测定需要 500μl 工作比色剂，混合后的比色剂应在 24h 内使用。

4) 蛋白定量操作步骤：

(1) 用 2mg/ml 浓度的 BSA 标准溶液制备标准曲线(0~25μg)； 1 2 3 4 5 6 2mg/ml BSA 标准品体积(μl) 0 2.5 5 7.5 10 12.5 BSA 标准品蛋白量(μg) 0 5 10 15 20 25

(2) 制备含 1~2μl 待测样本的微型离心管，一式两份；

(3) 每个微型离心管中(包括含 BSA 标准溶液的离心管)加入 250μl 沉淀剂 Precipitant，在振荡器上充分混匀并在室温下培育 2~3 分钟；

(4) 加入 250μl 辅助沉淀剂 Co-Precipitant，振荡混匀；

(5) 10000×g 室温离心 5 分钟，使蛋白沉淀；

(6) 用枪头快速吸去上清，小心避免离心沉淀再溶或分散开，再次短暂离心将残余的上清液集 中至管底，用微量移液管吸去残余的上清液；

(7) 每个管中加入 50μl 铜溶液 Copper solution 和 200μl 去离子水，彻底振荡混匀，确保沉淀完 全再溶解；

(8) 每个管中加入 500 μl 工作比色剂，应确保以最快的速度加入，并立即振荡混匀；

(9) 室温下孵育 15~20 分钟；

(10) 吸取 200μl 各个样本至 96 孔板中，以去离子水进行调零，测定样本和标准液的 480nm 波长吸光率；

(11) 酶标仪的使用如下：

a. 打开酶标仪后部电源，开机后至主菜单 manual meals 下；

b. 点击向右键→，至波长菜单，点击 Enter 键进入， 输入主波长为 meal-flt：480nm 参照波长为 Ref-flt：/ 点击 Enter 键确定

c. 测量台自动弹出，放入 96 孔板，按任意键将弹回测量台，开始测量；

d. 测量结束，测量台自动弹出；

e. LED 屏幕显示测量结果并手动记录；

f. 取出 96 孔板，点击退出键 esc 至主菜单下；

g. 点击向上键↑，使测量台自动弹回，完成测量关闭电源。

(12) 根据标准溶液蛋白质的含量和吸光率，绘标准曲线，并得到曲线方程 y=ax+b；

(13) 将样本的吸光率为 y 值，计算得到 x 值即样本浓度 样本的实际浓度(μg/μl) =样本理论测量浓度 μg/样本体积 μl 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 5 10 15 20 25 480nm吸光率 标准品质量(ug)

【注意事项】：

1. 使用超声破碎仪进行细胞裂解时，样本体积需超过150ul；

2. 使用 2D Quant 进行定量时，室温孵育时间不要超过20min，时间越长显色颜色越深。