1. 试剂 (1) PBS (2) 2D 裂解缓冲液 (3) 2D clean-up 纯化蛋白试剂盒 (4) 2D Quant 蛋白定量试剂盒
2. 设备:低温高速离心设备、振荡器、酶标仪、超声破碎仪
1.1 细胞样本处理 (1)培养细胞的收集:以胰酶消化细胞,反复吹打使其脱落,离心收集细胞(室温,1000g, 2min);
(2) 用磷酸缓冲液(PBS)洗细胞 3 次(室温,1000×g, 2min);
(3) 将细胞分装到 1.5ml Eppendorf 管中,吸干残留的 PBS;
(4) 加入裂解缓冲液(1.5x10 6 个细胞大约加入 100µL 裂解液),在室 温振荡 1h,使其充分溶解;
(5) 4°C,12,000×g,离心 0.5~1h;
(6) 吸取上清以2D clean-up试剂盒进行蛋白纯化,或保存在-80°C备用。
对大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质而言,同样没有一种通用的程序。但遵循的原则基本相同。下面列出一种对植物树叶总蛋白质的方法。
(2) 用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末,每1g 样品加入0.5ml 裂解液,使用组织匀浆器 匀浆30 s,进行超声裂解60 s;
(3) 将组织悬液4℃,13000×g 离心10 min;
(4) 取上清液,4℃,13000×g 离心1h;
(5) 取上清以2D clean-up试剂盒进行蛋白纯化,或保存在-80°C备用。
蛋白质样本在 1.5ml 微型离心管中处理,如不特殊说明,所有步骤均应在冰浴上进行。
(1) 将体积 1~100μl 的蛋白质样本(含 1~100μg 蛋白质)置于 1.5ml 微型离心管中;
(2) 加入 300μl 沉淀剂 Precipitant,在振荡器上充分混匀 20s。冰浴中(4~5℃)15 分钟;
(3) 加入 300μl 共沉淀剂 Co-Precipitant,振荡混匀 20s;
(4) 将离心管置于微型离心机中,离心管的盖轴向外。以 13000×g,4℃离心 5 分钟。离心完成后立即将离心管取出。此时管中应可见小沉淀;
(5) 应立即进行下一步以防止沉淀再溶解或播散开。轻轻以 200μl 枪头吸去上清,不要搅散沉淀;
(6) 将离心管的盖轴和离心沉淀向外,再次离心30s,使残余液体沉降至管底,用移液管将残余的上清液移去,这时管中应看不见任何液体成分;
(7) 保持沉淀不变,在其上面加入 40μl 共沉淀剂 Co-Precipitant,冰浴 5分钟;
(8) 将离心管小心地置于微型离心机中,离心管的盖轴向外,13000×g,4℃离心 5 分钟。用移液管小心移去上清液;
(9) 在沉淀中加入25μl 去离子水,振荡5~10 秒,使沉淀散开,但并未溶解于水中;
(10) 在管中加入 1ml 洗涤缓冲液 Wash Buffer (在-20℃下至少预冷1小时)和 5μl 洗涤添加剂 Wash Additive,充分振荡直至沉淀完全散开,使溶液呈现云雾状。此步洗涤至关重要,是去处杂质的重要步骤;
(11) 将管在-20℃下培育至少30分钟,每10分钟振荡 20~30 秒。在这种状态下,管子可以在- 20℃下储存最多一周,其蛋白质发生降解或修饰的可能性最少;
(13) 迅速地倾倒上清并将离心管倒置于滤纸上,可见白色沉淀,室温下干燥 5~10min,注意不 要过度干燥沉淀,否则再溶解就会很困难;
(14) 用 50~100μl 水化液溶解沉淀,在室温下孵育,振荡或用移液管抽吸使之完全溶解。如果沉淀过大或过干,再溶解会比较困难。用超声波处理或用样本研磨试剂盒处理可加速再溶解;
(15) 进行蛋白定量并同时 13000×g,4℃离心30分钟,去掉所有不溶物质和泡沫,直接进行水化上样;或者进行定量后保存在-80°C,在样本水化上样前13000×g,4℃离心30分钟, 尽可能去处样本中的不溶物。
1) 2D Quant 蛋白定量试剂盒组成 :沉淀剂、辅助沉淀剂、铜溶液、比色剂 A、比色剂 B、 牛血清白蛋白(BSA)标准溶液 2mg/ml
2) 所需条件 :微型离心设备、1.5ml 离心管、振荡器、酶标仪,96 孔板
3) 准备注意事项 :开始操作前,先制备工作比色剂,即将 100 份比色剂 A 与 1 份比色剂 B 混合,每个样本测定需要 500μl 工作比色剂,混合后的比色剂应在 24h 内使用。
(1) 用 2mg/ml 浓度的 BSA 标准溶液制备标准曲线(0~25μg); 1 2 3 4 5 6 2mg/ml BSA 标准品体积(μl) 0 2.5 5 7.5 10 12.5 BSA 标准品蛋白量(μg) 0 5 10 15 20 25
(2) 制备含 1~2μl 待测样本的微型离心管,一式两份;
(3) 每个微型离心管中(包括含 BSA 标准溶液的离心管)加入 250μl 沉淀剂 Precipitant,在振荡器上充分混匀并在室温下培育 2~3 分钟;
(4) 加入 250μl 辅助沉淀剂 Co-Precipitant,振荡混匀;
(5) 10000×g 室温离心 5 分钟,使蛋白沉淀;
(6) 用枪头快速吸去上清,小心避免离心沉淀再溶或分散开,再次短暂离心将残余的上清液集 中至管底,用微量移液管吸去残余的上清液;
(7) 每个管中加入 50μl 铜溶液 Copper solution 和 200μl 去离子水,彻底振荡混匀,确保沉淀完 全再溶解;
(8) 每个管中加入 500 μl 工作比色剂,应确保以最快的速度加入,并立即振荡混匀;
(10) 吸取 200μl 各个样本至 96 孔板中,以去离子水进行调零,测定样本和标准液的 480nm 波长吸光率;
a. 打开酶标仪后部电源,开机后至主菜单 manual meals 下;
b. 点击向右键→,至波长菜单,点击 Enter 键进入, 输入主波长为 meal-flt:480nm 参照波长为 Ref-flt:/ 点击 Enter 键确定
c. 测量台自动弹出,放入 96 孔板,按任意键将弹回测量台,开始测量;
f. 取出 96 孔板,点击退出键 esc 至主菜单下;
g. 点击向上键↑,使测量台自动弹回,完成测量关闭电源。
(12) 根据标准溶液蛋白质的含量和吸光率,绘标准曲线,并得到曲线方程 y=ax+b;
(13) 将样本的吸光率为 y 值,计算得到 x 值即样本浓度 样本的实际浓度(μg/μl) =样本理论测量浓度 μg/样本体积 μl 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 5 10 15 20 25 480nm吸光率 标准品质量(ug)
1. 使用超声破碎仪进行细胞裂解时,样本体积需超过150ul;
2. 使用 2D Quant 进行定量时,室温孵育时间不要超过20min,时间越长显色颜色越深。