目的及应用：

应用于细胞冻存。

试剂及设备：

培养液，胰蛋白酶（0.25%），DMSO（分析纯），安全柜，离心机，恒温水浴锅， 冰箱（4℃/-20℃），显微镜，培养箱，液氮罐，吸管，培养瓶，枪头，移液管， 50ml 离心管， 冻存管（1～2ml）微量加样枪，记号笔，移液枪，冻存盒（异丙醇 冻存盒。异丙醇在冷冻细胞的过程中可以辅助实现缓慢降温，直接从室温放进-80℃ 可以达到近似于 1℃/min），

实验原理：

细胞冻存的基本原则是缓慢冷冻，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通 透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而 减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

实验步骤：

1. 配制含 10%DMSO、20%小牛血清的冻存培养液 4mL。

2. 取出生长良好的细胞。

3. 吸除旧的培养液：拿出吸管（要拿吸管的上端），插入与抽滤瓶相连的橡胶管 中，在酒精灯外焰灼烧灭菌，细胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的培 养液，将用后的吸管弃于废弃缸里。

4. 消化： 北京协和医院中心实验室实验指南 拿出 5mL 移液管，插入电枪中，酒精灯过火灼烧，吸取 2mL 0.25%胰酶，混匀， 放于 37℃孵箱中消化 5-6min。 取下用后的移液管。

5. 中和： 从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被完全消化下来，5mL 灭菌后移液 管加入 3mL 培养液终止消化。

6. 离心收集细胞： 配平后离心 200×g，3min。将新培养液加入新培养瓶中，2mL／瓶（培养瓶底面积为25cm²）。

7. 分装冻存：将细胞分装入冻存管中，每管 1mL。

8. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。

9. 冻存：细胞冻存盒，里面有异丙醇，直接放入-80 过夜，冻存盒自动缓慢降温。然后-196℃液氮保存。

注意事项：

1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；

2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；

3．冻存要用新配制的培养液。